父は近江佐々木氏庶流の堀部親真。幼少の頃、両親を失う。永正13年（1516年）、五山文学の中心である京都相国寺に入って喝食となり、詩文や書を学ぶ。この頃、姓を曲直瀬とする。享禄元年（1528年）、関東へ下って足利学校に学ぶ。ここで医学に興味を抱いたと言われる。名医として知られた田代三喜斎と出会い、入門して李朱医学（当時明からもたらされた最新の漢方医学）を修める<ref>山田光胤「日本漢方医学の伝承と系譜」『日本東洋医学雑誌』1996年、46巻、4号、p514</ref>。天文15年（1546年）ふたたび京都へ上ると、還俗して医業に専念。将軍足利義藤（義輝）を診察し、その後京都政界を左右した細川晴元・三好長慶・松永久秀などの武将にも診療を行い、名声を得て、京都に啓迪院（けいてきいん）と称する医学校を創建した。

永禄9年（1566年）、出雲月山富田城の尼子義久を攻めていた毛利元就が在陣中に病を得た際に、これを診療し、『雲陣夜話』を記す。天正2年（1574年）には『啓迪集』を著し、同年に正親町天皇に拝謁を許され、診療を行い、同書を献上した。正親町天皇は僧策彦周良に命じて序文を作らせている。この際に翠竹院の号を賜る。織田信長が上洛後は、信長の診察も行い、名香蘭奢待を下賜された<ref>佐賀純一「曲直瀬道三と蘭奢待」『漢方の臨床』2005年、52巻、11号、p1775</ref>。

著書は『啓迪集』以外にも『薬性能毒』『百腹図説』『正心集』『指南鍼灸集』『『弁証配剤医灯』など数多く、数百人の門人に医術を教え、名医として諸国にその名を知られた。天正12年（1584年）、豊後府内でイエズス会宣教師オルガンティノを診察したことがきっかけでキリスト教に入信し、洗礼を受ける（洗礼名はベルショール）。天正20年（1592年）には後陽成天皇から橘姓と今大路の家号を賜る。文禄3年（1594年）1月4日没した。死後、正二位法印を追贈された。子の玄朔が後を継ぎ、代々官医として続いた。