永禄4年（1561年）2月19日、今川氏の家臣である井伊直親の長男として、遠江国井伊谷（現在の静岡県浜松市北区引佐町井伊谷）で生まれる。井伊氏は先祖代々、井伊谷の国人領主であり、直政の祖父（または一族）井伊直盛は今川義元に仕えて桶狭間の戦いで戦死した。父の井伊直親は、直政の生まれた翌、永禄5年（1562年）に謀反の嫌疑を受けて今川氏真に誅殺される。直親の死によって、遺児直政（当時の名は虎松）は僅か2歳であったため、新たに直親の従兄妹に当たる祐圓尼が井伊直虎と名乗り、井伊氏の当主となった。

その後、直政の生母が今川氏の家臣である松下清景と再婚したため、直政は井伊の姓を失い、松下虎松と名乗るようになる。

しかし、やがて井伊氏は井伊谷の所領を失い、まだ幼かった直政も今川氏に命を狙われる日々を送っていたが、新野親矩に救出されて、その後は養母である直虎に育てられた。天正3年（1575年）、徳川家康に見出され、井伊の姓に復帰を命じられるとともに虎松を万千代と改めて、井伊万千代と名乗るようになる。さらにかつての井伊氏の旧領である井伊谷を与えられ、家康の小姓として取り立てられた。同年、家督を代行していた養母の直虎が亡くなったため、正式に当主となった。